基于PiggyBac载体的高效CRISPR基因组和RNA编辑工具|Bioactive Materials

近期，宾夕法尼亚州立大学练小军和普渡大学包小平教授在科爱出版创办的期刊Bioactive materials上发表文章：基于PiggyBac载体的高效CRISPR基因组和RNA编辑工具。该团队开发了两个包含 Cas9/gRNA 和诱导型 Cas13d/gRNA 组件的一体化载体，分别用于高效的基因组编辑和 RNA 干扰，有望成为研究人多能干细胞分化过程中基因功能的有效工具。

01

研究内容简介

CRISPR/Cas 介导的人多能干细胞 (hPSC) 基因组编辑已广泛应用于开发体外疾病模型、药物筛选和细胞疗法。为了有效地导入 CRISPR 组件，宾夕法尼亚州州立大学练小军团队与普渡大学的包小平团队联合开发了两个包含 Cas9/gRNA 和诱导型 Cas13d/gRNA 组件的一体化载体，分别用于高效的基因组编辑和 RNA 干扰（图一）。这些载体利用 PiggyBac 转座子系统，允许CRISPR 组件在人类多能干细胞中稳定表达。Cas9载体PB-CRISPR在蛋白质编码基因和长链非编码 RNA 中均表现出高效率（高达 99%）的基因敲除。另一个诱导型 Cas13d 载体通过优化的 gRNA 设计实现了极高的 RNA 敲低效率（如CD90 敲低 98%）。总之，这些PiggyBac CRISPR 载体将成为研究人类多能干细胞分化过程中基因功能的有效工具。

图1 基于PiggyBac载体的高效CRISPR基因组和RNA编辑工具示意图

1. PB-CRISPR 能够稳健地敲除在 hPSC 中表达的蛋白质编码基因

该团队设计了一个一体式 PiggyBac 系统 PB-CRISPR 来提供 hSpCas9 和 gRNA，以及用于药物选择的嘌呤霉素抗性基因（图 2A）。首先在 hPSC 中表达的蛋白质编码基因中测试了该系统（图 2B-H ）。THY1 编码 CD90，这是一种在 hPSC 中表达的膜糖蛋白，在细胞粘附和通讯中具有潜在的作用 。他们选择了一个靶向 THY1 基因第三个外显子的 gRNA，并将其克隆到PB-CRISPR 载体中（图 2B）。PB-CRISPR 质粒的单独递送导致细胞中 CRISPR 盒的瞬时表达，一周后，通过流式细胞术检测到 7.8% CD90 阴性细胞（图 2C）。相比之下，PB-CRISPR 和表达高活性转座酶的质粒的共同递送导致 Cas9-gRNA-Puro 构建体插入基因组。在用嘌呤霉素进行药物选择 2 周后，超过 90% 的 hPSC 呈 CD90 阴性（图 2C ），这表明通过 PB-CRISPR 稳定表达 CRISPR 导致比瞬时 DNA 递送更高的敲除效率。通过针对 CAS9 的免疫染色证实了 PB-CRISPR 构建体在药物选择的细胞中的稳定表达（图 2D）。然后他们测试了 CTNNB1，这是另一种编码 β-连环蛋白的蛋白质编码基因，该基因在 hPSC 中组成型表达，并作为 Wnt 信号通路中的重要效应器发挥作用。他们设计了一个靶向第五个外显子的 gRNA，它会导致 CTNNB1 基因的长缺失（图 2E）。通过针对 CAS9 的免疫染色证实了 PB-CRISPR 构建体的稳定表达（图 2F）。与瞬时质粒转染产生的 7.49% 敲除相比（图 2G），在嘌呤霉素选择一周后，PB-CRISPR 的稳定表达导致 CTNNB1 敲除的细胞为 39.3%（图 2H）。他们还观察到将药物选择再延长一周并没有进一步提高敲除效率，这表明 PB-CRISPR 稳定细胞系的敲除效率可以在药物选择后的一周内达到最大值。总之，这些数据表明 PB-CRISPR 介导的蛋白质编码基因敲除的高效率可以通过产生稳定的 hPSC 系来实现。

图2 PB-CRISPR实现多能干细胞中正在表达的基因的高效敲除

2. PB-CRISPR 能够在 hPSC 中稳健地敲除沉默基因

他们接下来测试了该系统是否可以应用于不在 hPSC 中表达的基因，这需要更多的基因分型步骤。在这里，他们选择了基因 IL32，它编码白细胞介素 32，一种人类促炎细胞因子。他们设计了两个 gRNA，它们靶向编码 DNA 序列 (CDS) 区域中的第三个和第八个外显子和两对用于基因分型的引物（图 3A）。在用 PB-CRISPR-IL32KO 和 PBase 质粒进行核转染后，对来自细胞混合物的基因组 DNA 进行 PCR 显示，产生了带有外部引物的短带，其为 277 bp，而不是野生型 (WT) 细胞中存在的 3752 bp，表明至少有一个等位基因由于 Cas9 切割而被修饰（图 3B）。此外，带有内部引物的 810 bp 条带表明，另一个条带并未完全缺失，但可以在外显子 3 或外显子 8 中部分修饰。在用嘌呤霉素进行药物选择两个月后，他们观察到 CAS9 表达保留在许多细胞中（图. 3C) 并因此从混合物中衍生出单细胞克隆。所有单细胞克隆的 PCR 筛选显示出与混合细胞相似的模式（图 3D ）。进一步的基因分型揭示了一个 3475 bp 的缺失，它完美地位于 Cas9 的两个切割位点之间（图 3E）。

图3 PB-CRISPR实现多能干细胞中非表达基因的高效敲除

3.PB-CRISPR 能够在 hPSC 中稳健地敲除 lncRNA

他们接下来应用 PB-CRISPR 敲除在 hPSC 中不表达的长非编码 RNA (lncRNA)。在这里，他们选择了基因 BANCR，这是一种据报道通过 ERK 信号通路与细胞增殖、迁移和侵袭相关的 lncRNA。设计了一个 gRNA 以靶向 BANCR 的第一个外显子（图 4A），并设计了两对引物用于基因分型。三个单细胞衍生菌落的 PCR 反应显示没有明显的截断条带，表明小的插入或缺失（图 4B）。使用克隆 1 进行的进一步 TA 克隆显示两个等位基因中都有 3 bp 缺失（图 4C），这与 inDelphi 的结果一致，inDelphi 是一种用于预测 CRISPR 基因组编辑的报告平台。他们之前通过大量 RNA 测序发现了在 hPSC-心肌细胞 (hPSC-CM) 分化过程中 BANCR 的动态表达模式，其在从第 15 天开始的晚期富集（图 4D）。通过鉴定的 BANCR-KO hPSC 系，他们观察到在心肌分化的第 30 天 BANCR 表达可忽略不计，与野生型细胞中的高 BANCR 表达相比。有趣的是，他们还观察到 NKX2.5 的表达显着降低，这与人类心脏发育和先天性心脏缺陷的形成有关（图 4E）。这表明 BANCR 可能在心脏分化中起作用。

图4 PB-CRISPR实现多能干细胞中长链非编码RNA的高效敲除

4. 诱导型 PiggyBac Cas13d 系统可实现稳健的 RNA 敲低

除了基因组编辑，他们还构建了一个可诱导的一体化 PiggyBac 系统 (XLOne-Puro-Cas13d-eGFP-U6-gRNA) 用于 RNA 编辑，其中包含 PiggyBac 反向末端重复序列，这些重复序列位于由三个启动子驱动的多个基因元件的两侧.第一个启动子是 EF1a 核心启动子，它控制 Tet-On 3G 反式激活蛋白和嘌呤霉素抗性基因的表达，然后是由 U6 启动子驱动的 gRNA 序列。第三个启动子是控制 Cas13d 和 eGFP 荧光报告基因表达的 TRE3G 启动子（图 5A）。他们首先应用该系统来中断基因 THY1，因为它在 hPSC 阶段的表面表达。设计了三个 gRNA并克隆以测试编辑效率（图 5B）。IMR90C4 iPSCs 与 XLOne-Puro-Cas13d-eGFP-U6-THY1gRNA 质粒结合，并通过嘌呤霉素筛选约两周。添加强力霉素 (dox) 在 iPSC 中诱导 eGFP 表达，表明构建体设计成功（图 5C）。经过四天的 dox 治疗后，他们收集细胞以通过 qPCR 测试 RNA 水平的 THY1 表达，并通过流式细胞术测试蛋白质水平的 THY1 表达（图 5D 和 E）。qPCR 数据显示 THY1 KD 中三种 gRNA 的不同表现（图 5D），其中 gRNA2 和 gRNA3 导致 THY1 mRNA 显着下降，而 gRNA1 对 THY1 KD 没有影响。他们对 CD90 表达结果的流式细胞术表明 gRNA3 几乎可以耗尽 THY1 蛋白的表达，达到 98% 的敲低效率（图 5E）。

图5 可诱导PiggyBac Cas13d系统实现高效RNA编辑

接下来，他们在 SOX17 上测试了他们的 Cas13d 敲低系统，SOX17 是定形内胚层的标记基因 [19]。Cas13d gRNA 旨在靶向 3'UTR 区域（图 5F）。与 XLOne-Puro-Cas13d-eGFP-U6-SOX17gRNA 集成的 H1 hESC 系用于使用他们的小分子 GiBi 方法 进行 DE 分化（图 5G）。具体来说，在第 0 天用 CHIR99021 和 Dorsomorphin 处理细胞，然后在补充有人血清白蛋白和抗坏血酸的基础培养基中培养接下来的三天。每日图像跟踪有或没有 dox 治疗的形态变化（图 S3A）。Dox 添加导致 DE 分化的第 1 天和第 2 天细胞融合度降低。此外，在 dox 处理下第 4 天的细胞未能产生密集的细胞簇，并且一些细胞仍然表现出具有大细胞核的干细胞形态。第 4 天细胞的 qPCR 数据显示，dox 处理导致 SOX17 mRNA 表达显着降低（图 5H）。在添加 dox 后，还观察到 SOX17 阳性细胞百分比从平均 40% 显着降低至 15%（图 5I 和 J）。该构建体在另一个 H9 hESC 系中表现出类似的 SOX17 敲低功能（图 5K）。为了排除 SOX17 敲低由 dox 毒性引起的可能性，他们还使用有或没有 dox 存在的 WT H1 细胞测试了 DE 效率，发现添加 dox 不会损害第 4 天 DE 细胞中 SOX17 的表达（图 2）。所有这些数据表明他们的 Cas13d 系统可以诱导强大的 RNA 敲低。

02

论文第一/通讯作者简介

第一作者：蒋宇倩

宾夕法尼亚州立大学生物医学工程系2016级博士研究生。从事胚胎干细胞分化及基因编辑工作。

通讯作者：练小军

宾夕法尼亚州立大学生物医学工程系副教授，生物系副教授，博士生导师。研究领域涉及干细胞分化、基因编辑、modRNA以及免疫工程。

课题组主页：https://www.bme.psu.edu/labs/Lian-lab/

通讯作者：包小平

普渡大学化学工程系助理教授，博士生导师。研究方向包括基于人类多能干细胞的细胞疗法和疾病模型，以及生物信息学在人类发育和疾病方面的应用。

课题组主页：https://sites.google.com/view/xiaoping-bao/home?authuser=0

03

资助信息

该研究获美国国立卫生研究院（R21EB026035，R21AI149312），美国国家科学基金会（CBET-1943696）以及宾州州立大学启动资金的支持。

04

原文信息

Yuqian Jiang, Rachel Catherine Hoenisch, Yun Chang, Xiaoping Bao, Craig E. Cameron, Xiaojun Lance Lian.

Robust genome and RNA editing via CRISPR nucleases in PiggyBac systems.

Bioactive Materials, 14 (2022) 313-320.

点击阅读原文，查看文章详情

Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。

位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。

CiteScore 2021: 14.3。